Perbedaan Antara Dua Metode Pada Sekuens DNA
Nama: Agustina Dita K (B1J006030)
Biyan Tabritantyo (B1J006032)
Ika Oksi Susilawati (B1J006034)
Kelas: B1
E-mail: tha2_dytha@yahoo.com
bitan_tp@yahoo.com
oksy_t3tra@yahoo.co.id
Blog: http://cikusa.wordpress.com
http://biyan032.wordpress.com
http://oksyt3tra.wordpress.com
Topik: KM0-SG-01
RINGKASAN
Sekuens DNA merupakan suatu proses mengurutkan atau mensekuens DNA yang terdapat dalam makhluk hidup agar dapat dibaca dengan mudah. Terdapat dua metode untuk sekuens DNA, yaitu metode terminasi rantai dan metode degradasi kimia. Kedua metode tersebut memiliki perbedaan satu sama lain. Metode terminasi rantai merupakan salah satu metode sekuens DNA, dimana sekuen dari molekul DNA untai tunggal ditentukan dengan sintesis secara enzimatik pada rantai polinukleotida yang komplementer. Terminasi rantai ini pada posisi nukleotida yang spesifik. Molekul DNA untai tunggal yang berbeda panjangnya walau hanya satu nukleotida dapat dipisahkan satu sama lain dengan elektroforesis gel poliakrilamid. Fragmen-fragmen dari suatu molekul DNA yang panjangnya 10 sampai 1500 nukleotida dapat dipisahkan menjadi suatu seri pita (Brown,2002).
Sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi atau terminasi rantai dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3’nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3’nya (http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/sekuensing-dna).
Enzim polimerase tidak bisa membedakan antara dNTP dan ddNTP. Penggabungan ddNTP ke dalam untai nukleotida yang baru disintesis akan menghentikan sintesis DNA, karena ddNTP tidak memiliki ujung 3′ hidroksil yang diperlukan untuk mensintesis nukleotida berikutnya. Untuk memulai percobaan sekuensing terminasi rantai, suatu primer oligonukleotida ditempelkan ke DNA templat. Primer diperlukan karena DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA pada suatu molekul yang seluruhnya untai tunggal. Harus ada daerah untai ganda pendek untuk memberikan ujung 3′ dimana enzim dapat menambahkan nukleotida yang baru. Primer juga memiliki peranan penting untuk menentukan daerah mana pada molekul templat yang akan disekuens. Kebanyakan percobaan sekuensing digunakan suatu primer yang universal. Primer ini komplemen dengan bagian dari DNA vektor yang langsung bersambungan dengan DNA yang baru. Primer universal yang sama memberikan sekuens dari setiap bagian DNA yang telah diligasikan ke vektor. Jika DNA yang disisipkan ke vektor lebih panjang dari 750 pasang basa maka hanya sebagian dari sekuen yang akan diperoleh (Brown, 2002).
Gambar 1. Metode Terminasi Rantai
Sumber : figure 6.2 (Brown, 2002)
Metode degradasi kimia (chemical degradation method), yang biasanya dikenal dengan metode Maxam-Gilbert, karena metode ini dikembangkan oleh Maxam dan Gilbert pada tahun 1977. Sekuen molekul DNA untai ganda ditentukan dengan perlakuan menggunakan bahan kimia yang memotong molekul pada posisi nukleotida tertentu. Fragmen DNA yang akan disekuens dilabel salah satu ujungnya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3’. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Ikatan antara fosfat dan gula dipotong dengan piperidin (modifikasi waktu pemotongan dan konsentrasi piperidin akan menghasilkan potongan dengan berbagai ukuran). Basa dimodifikasi secara spesifik (Brown, 2002).
Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C (http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/sekuensing-dna)
Kedua metode tersebut awalnya sama-sama populer, tetapi dalam perkembangan berikutnya metode terminasi rantai lebih disukai. Alasan utama adalah metode ini lebih mudah di automasi. Metode degradasi kimia juga memiliki kelemahan lain karena menggunakan bahan kimia yang beracun dan berbahaya bagi kesehatan peneliti yang menggunakan metode tersebut.
Banyak perbedaan pada kedua metode tersebut, yaitu pada metode terminasi rantai menggunakan sekuens DNA tunggal identik, disintesis secara enzimatik pada rantai polinukleotida yang komplementer, terminasi rantai ini menggunakan nukleotida yang spesifik, pemisahan molekul DNA tunggal biasanya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid. Metode ini juga menggunakan primer yang ditempelkan pada posisi yang sama pada setiap molekul dan menggunakan DNA polimerase serta keempat deoksi ribosa trifosfat (dNTPs – dATP, dCTP, dGTP dan dTTP) sebagai substrat. Dideoksinukleotida (ddNTP) juga digunakan dalam metode ini, dimana ddNTP dalam jumlah yang lebih sedikit daripada dNTP.
Berbeda dengan metode terminasi rantai, metode degradasi kimia tidak popular digunakan. Metode degradasi kimia ini menggunakan bahan kimia, sekuens untai ganda yang digunakan dalam metode ini, salah satu fragmen DNA yang akan digunakan dilabeli dengan menggunakan radioaktif, tidak memerlukan primer dan DNA polymerase dalam sekuens DNA.
Daftar Pustaka
Brown, T.A (2002) DNA in Genomes, 2nd ed.,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=genomes.section.5234
Diakses tanggal 23 Oktober 2008
http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/sekuensing-dna
SITUS TERKAIT
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animation/sangerseq.swf
http://smcg.cifn.unam.mx/enpunam/03EstructuraDelGenoma/animaciones/secuencia.swf
